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El
cultivo “in Vitro” se hace en frascos cerrados y en
condiciones “controladas” y “estériles”. El sustrato
de cultivo conocido normalmente como medio de cultivo
ha de contener los elementos necesarios para que las
plantas puedan crecer lo suficiente como para después
ser trasplantadas al sustrato definitivo.
MATERIALES.
¿Qué materiales nos hacen falta para llevar
a cabo el cultivo in Vitro?.
| 1.- |
Medio
de cultivo: componentes,
obtención,
mezclado,
esterilización y
utilización, etc... |
| 2.- |
Cámara
de esterilidad: descripción-construcción, esterilización
y uso. |
3.-
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Frascos
de cristal con tapa (pueden ser potitos de niño,
frascos pequeños de mermelada, miel, etc). |
| 4.- |
Una
olla a presión (que todo el mundo tiene en casa).
Cuanto más grande mejor. |
5.-
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Bisturí y
pinzas metálicas largas (más de 20 cm). Se compran en tiendas de materiales de laboratorio
y ortopedia. |
| 6.- |
Alcohol
de 96º. |
7.-
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Algunos
tarros de plástico (polipropileno PP) para microondas
que sean bajos. (los he visto en tiendas “todo
a cien” a precios económicos). |
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.- El medio de cultivo: sus componentes.
Estos elementos son básicamente:
agua, sales minerales, azúcar, vitaminas, y en algunos
casos hormonas vegetales. Además hace falta un elemento
que dé consistencia al medio que suele ser el agar (antiguamente
se usaba gelatina), aunque también es posible usar vermiculita.
La adición de extracto de levadura
es muy beneficiosa pues proporciona vitaminas inusuales,
algo de nitrógeno en forma de aminoácidos y oligopéptidos
(fragmentos muy cortos de proteína de entre dos y 10
aminoácidos), oligoelementos y cofactores.
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PROPORCIÓN
DE CADA ELEMENTO BÁSICO A MEZCLAR
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Abono mineral
20-20-20 (sin urea) |
1 gr |
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Agar |
8 gr |
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Agua |
1 Litro |
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Azúcar comercial |
10 gr |
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Extracto de
levadura |
1 gr |
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Complejo de
vitamina B |
1 ampolla, vial |
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Otros aditivos
(leche de coco, plátano, etc) |
Leer bajo esta tabla |
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Se puede añadir también: leche de
coco verde filtrada por un filtro normal de café (20 ml por cada
litro de medio), papilla de banana (muy fina) a razón
de media banana por litro ó 25 ml de zumo de piña natural
filtrado (NO el de Tetrabrik), aunque el zumo de piña
no lo recomiendo si no se tiene forma de controlar el
pH, pues es muy ácido y hay que corregirlo después,
necesitando entonces de aparataje. Hay peachimetros
muy económicos que siempre son útiles, pero se puede
prescindir de ellos.
A tener en cuenta que:
-
La
leche de coco suele ir mejor para germinación o
cultivo de tejidos y el plátano para el desarrollo
de plántulas. No usar los dos a la vez.
-
La
banana como aditivo funciona muy bien (que no esté
pasado, los entre verdes y amarillos son ideales).
-
El
agua preferiblemente destilada, pero se podría usar
de lluvia siempre que esté bien limpia.
-
Si
se usa vermiculita como soporte, no se añade agar.
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Obtención
de los elementos anteriores:
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Abono mineral:
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En cualquier tienda de abonos. Si además trae
magnesio, hierro y oligoelementos, mejor aún.
Si no se encuentra de 20-20-20, se corrige de
forma proporcional (Hay que tener en cuenta que
la regla de tres es inversa). Un ejemplo, sería
usar 2 gramos si el abono fuera de 10-10-10 ó
2,8 gramos, si el abono fuera de 7-7-7. Sin embargo
es conveniente irse a la mayor concentración posible,
debido a que cuanto más puro esté, menos residuo
insoluble queda. |
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Azúcar comercial: |
Cualquier supermercado. |
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Extracto de levadura,
vitamina B y agar: |
En farmacias, tiendas de dietética y productos para deportistas. |
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Bananas, cocos, piñas: |
En cualquier comercio. |
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¿Cómo mezclamos todo esto?
Simplemente
se disuelve todo en una parte del agua excepto el agar.
Si se usa plátano debe hacerse papilla muy fina con
una fracción de agua y después mezclarlo todo. Finalmente
verificar el pH si se usa zumo de piña natural
(debe quedar entre 5.5 y 6) y añadir el resto de agua
necesaria. El
pH lo podemos corregir adicionando una base fuerte (hidróxido
sódico o potásico generalmente).
Finalmente añadir el agar.
Esto se mete en el microondas y como el agar tarda en disolverse, para no
calentar mucho la mezcla, serán necesarios
varios golpes de calor hasta que se disuelva. Entre
golpe y golpe se saca del microondas y se agita con
una espátula o una cuchar.
Una
vez disuelto el agar se espera a que enfríe un poco
(básicamente para uno evitar quemarse) sin que llegue
a volverse sólido y se vierte en los frascos de cultivo
la cantidad necesaria. Finalmente se meten en la olla
a presión para ser esterilizados.
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Atención:
Este
medio o substrato es muy rico en nutrientes,
y al igual que crecen las plantas lo pueden
hacer también hongos, levaduras y bacterias
con lo cual necesitaremos que esté estéril.
Los
medios una vez mezclados deben ser esterilizados,
no pueden esperar en la nevera más de un día.
Una vez esterilizados pueden conservarse hasta
un mes, máximo dos a temperatura ambiente, o
varios meses en la nevera (no el congelador).
Es
conveniente que mientras se disuelve el agar
la mezcla no llegue a hervir pues las vitaminas
se descomponen si hierve repetidas veces.
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.- Cámara de
esterilidad: características básicas.
En cultivo in Vitro hablamos
de esterilidad cuando no hay bacterias ni otros microorganismos:
sólo está vivo el material vegetal que queremos hacer
crecer.
Se hace una caja de metacrilato
de unos 40 cm de altura por 60 de ancho y 40 de profundidad,
sin fondo, que será la superficie de la mesa.
En la parte frontal se hacen
unos orificios adecuados para introducir las manos a
los que se les acoplan unos guantes largos. Por este
sistema podremos trabajar sin tocar los materiales que
estarán estériles.
La distancia
entre agujeros y sobre todo el tamaño de los mismos va
a ser variable, dependiendo principalmente de la altura
de la mesa, de la silla sobre la que trabajaremos y de
nuestra constitución física (a brazos más gruesos lógicamente
agujeros más grandes). Sin embargo en el agujero debe
haber algo de holgura para no cortarse en los brazos.
El modo de
acoplar los guantes también se puede hacer de varias formas:
Se pueden acoplar dos bolsas alargadas pegadas con cinta
aislante al agujero por el exterior y al fondo dejar una
abertura para las manos. Con las manos ya en la cámara
nos ponemos unos guantes de látex (tipo cirujano) que
se superponen parcialmente sobre la bolsa, pues son más
sensibles para trabajar. Estos se pueden tratar con alcohol
simplemente pulverizando con el que se va a esterilizar
la cámara de modo que se evitan contaminaciones. Otra
forma de acoplarlos es dejarlos permanentes, usando guantes
de cocina lo más sensibles posible acoplándolos a la bolsa
y fijándolos con cinta.
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PROCESOS
DE ESTERILIZACIÓN:
.-
Esterilización de materiales y medios
de cultivo
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Olla a presión grande, cuanto
más mejor. |
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Papel
de aluminio. |
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Tarros para microondas con la indicación PP (Polipropileno). |
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El medio de cultivo mezclado
como anteriormente se indicó en "¿Cómo
mezclamos todo esto?" se vierte en los frascos
de mermelada, echando unos 3 cm de altura.
Éstos se introducen en la olla
con la tapa del frasco floja pues si no se rompen (la
olla por supuesto con agua, pero que no rebose los frascos).
El
resto de los materiales (pinzas, tarros de microondas,
etc) puede ir sobre los frascos (nunca nadando en el agua).
También es conveniente tener trozos de papel de filtro
y papel de aluminio estériles para poder hacer cualquier
manipulación en esterilidad dentro de la cámara. Estos
se pueden esterilizar previamente en la olla en tarros
de microondas o envueltos en papel de aluminio.
Una vez que están todos los
materiales en la olla se cuecen 10 minutos (contados a
partir de que empieza a hervir). Pasado ese tiempo se
deja enfriar se sacan con cuidado y se aprietan (sin abrirlos)
las tapas de los frascos de medio de cultivo. Se deja
todo en un lugar fresco y seco hasta su uso.
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Atención:
Todos los materiales han de estar envueltos
en papel de aluminio y abrirlos sólo en la cámara
de esterilidad una vez esterilizada.
Es
conveniente no usar los frascos preparados con
el medio de cultivo hasta pasados tres o cuatro
días, desechando los que se hayan contaminado
(lo normal es que no se contamine ninguno).
Guardados en un lugar fresco, pueden usarse
hasta después de unos meses.
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A tener en cuenta que:
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Esterilización de Semillas y cápsulas:
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Papel de filtro (ya esterilizado) |
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Un recipiente con Lejía al 20% |
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Tres recipientes con agua esterilizada |
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Pinzas metálicas |
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Bisturí |
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Las semillas son muy pequeñas
por lo que se usan pequeños sobrecitos hechos con papel
de filtro, para esterilizar y lavar.
Cada
sobrecito no debería contener más volumen de semilla que
el equivalente a tres o cuatro granos de arroz. Esto supone
unas 2000 a 20000 semillas dependiendo de las especies,
cantidad más que suficiente para obtener suficientes seedlings.
Como dato orientativo, con cápsulas grandes se puede hacer
un mínimo de 10 ó 15 bolsitas.
Se esterilizan en lejía al 20% (1 parte de lejía y
4 de agua) durante 15-20 minutos, moviendo algo el sobrecito
de vez en cuando para que la lejía actúe más eficientemente
y no queden zonas no estériles, tratando de evitar que
se rompa y salgan las semillas, pues después nos será
casi imposible recogerlas. Después se lavan varias veces
en agua estéril. Para este proceso, es necesario tener un frasquito con lejía al 20% y cuatro frasquitos estériles con
agua para hacer cuatro lavados (2 ó 3 minutos cada lavado.
Para pasar las semillas de uno a otro se toman los sobrecitos
con las pinzas (que también han de estar estériles).
Si
se usan cápsulas verdes, éstas interiormente están estériles
(microbiológicamente), por lo que se manejan simplemente
con las pinzas a través de la lejía y los lavados. Además
no es necesario meterlas en los sobrecitos: se esterilizan
por fuera y después de los lavados se abren (longitudinalmente)
con el bisturí y se siembran las semillas inmaduras que
hay en el interior. Cada especie tiene diferentes tiempos
de recolección como cápsula verde y de maduración hasta
semillas secas. Estos tiempos son extremadamente variables
y van en ambos casos desde menos de un mes hasta varios
años.
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Atención:
Todos los materiales que
toquen las semillas han de estar estériles (frascos,
agua, etc), pues de lo contrario nos crecerán
hongos y bacterias en vez de las semillas.
Todo
el proceso (esterilización,
lavado y siembra) ha de hacerse en la cámara
de esterilidad (previamente esterilizada).
Del
bien hacer dentro de la cámara dependerá el
éxito del cultivo.
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.- Esterilización de la cámara
de esterilidad:
La cámara de esterilidad la
podemos esterilizar de dos maneras:
| a) |
Con
la aplicación de alcohol de 70%, proceso. |
| b)
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Con
lámparas germicidas, proceso.
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Existen en el mercado tubos o lámparas germicidas
fluorescentes económicas, semejantes a los de
los rayos UVA, que emiten radiación ultravioleta
y matan todo lo que hay en su radio de acción
en unas 2 horas, sustituyendo al tratamiento con
alcohol que es bastante engorroso. Estas lámparas
se usan de forma industrial en alimentación (cámaras
frigoríficas, pastelería, etc).
A
tener en cuenta que:
- Aunque
la exposición humana momentánea a esta radiación
no es nociva, no se debemos exponernos más
de 2 minutos. El inconveniente es que hay
que encenderla 2 horas antes de empezar a
trabajar para dejarla apagada mientras trabajamos,
pero es francamente útil. También es conveniente
cubrir la cámara con un paño para evitar accidentes
con la radiación.
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Procedimiento
con Alcohol:
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Introducimos
en la cámara todos los materiales (ya estériles)
con los que tengamos que trabajar que han salido
de la olla y están cubiertos por papel de aluminio,
pues una vez esterilizada la cámara no se puede
abrir, y si hay que hacerlo, la esterilización
ha de repetirse de nuevo. Se nebuliza cuidadosamente
con alcohol con la ayuda de un pulverizador toda
la cámara, de manera que matemos todos los microorganismos
que están continuamente flotando en el aire. Para
evitar que los materiales se nos empapen de alcohol
se cubren con papel de aluminio. Además es conveniente
tener dentro papel de cocina para recoger todo
el alcohol que se va depositando sobre la mesa.
Antes de empezar a trabajar se debe esperar 5
minutos a que se deposite todo el alcohol nebulizado. |
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Procedimiento
con lámparas germicidas.
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Encender las
lámparas durante dos horas, teniendo en cuanta
las precauciones mencionadas anteriormente. |
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Atención:
Durante la esterilización de la cámara,
a las semillas hay que cubrirlas con papel de
aluminio para que no les haga daño el alcohol
ni la radiación.
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Duración
de la esterilización de la
cámara:
Si
la cámara está más o menos estanca (que no entre aire) se
podría trabajar toda la tarde. Sin embargo, es conveniente
tener en la cámara un vasito con alcohol que nos permita
esterilizar de vez en cuando pinzas o bisturí, sobre todo
si trabajamos con diferentes semillas, pues algunas podrían
estar contaminadas y trasladar esta contaminación a otros
materiales. Una inmersión del material durante unos minutos
es suficiente (en una parada para tomar un café o descansar
un ratito). El instrumental así esterilizado debe ser secado
con un trozo de papel de filtro estéril previamente a volver
a trabajar, pues el alcohol también es nocivo para las semillas
de las orquídeas.
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En general, la germinación es mejor en oscuridad, así
que después mejor guardar los frascos en una caja bien
cerrada y observarlas semanalmente.
Después de unos 15 días a un
mes (a veces más) se empiezan a ver las semillas engrosar
y más adelante formar la yema apical y la primera raíz.
^
REPICADO
Cuando tienen aproximadamente
medio cm ya han consumido casi todo el nutriente, por
lo que se cambian al mismo medio fresco, también en esterilidad
dejando aproximadamente 10-30 plantitas por frasco y sacar
ya a la luz (no luz directa, puede ser cerca de una ventana
o en un lugar sin sol directo en el invernadero.
También se puede aplicar luz
(y sería lo mejor) con 2 fluorescentes puestos a unos
30 cm de los frascos que estén funcionando 16 horas al
día, pero encarece el proceso. Sin fluorescentes crecen
un poco más despacio, pero para uso particular pueden
valer perfectamente.
^
PLANTADO
EN SUSTRATO
Como norma general, cuando las plantas
tienen unos 3-4 cm de alto (estén suficientemente desarrolladas),
se pueden adaptar al sustrato.
Al
principio se debe usar un sustrato menos poroso (puede
ser vermiculita, abonada con abono líquido), y cubrirlas
con bolsitas de plástico invertidas tipo celofán. La adaptación
tiene que ser progresiva, pues estas plantitas tan pequeñas
se secan muy rápidamente.
También los botellines de agua
cortados por la mitad y puestos sobre la planta son ideales
para evitar la deshidratación rápida. Poco a poco se va
abriendo a intervalos de tiempo (o mejor haciendo pequeños
agujeros en los botellines)
hasta que la planta ya puede crecer y desarrollarse
sin protección como las demás.
Además, se hace necesario un
tratamiento con un funguicida, pues en esta etapa de adaptación
hay una fuerte tendencia a la infección por hongos. Cuando
se ha desarrollado adecuadamente se la puede instalar
en el sustrato definitivo que dependerá de la especie.
En laboratorio, con medios de
cultivo más controlados, la luz adecuada y aparataje se
pueden obtener plantas en menos de un año. En casa, en
aproximadamente un año, se podrían poner las plántulas
(seedlings) en sustrato, y a partir de otros dos años
(dependiendo de la especie) podrían florecer.
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Tengo que señalar que esta no
es la forma en que se hace el cultivo in Vitro en un laboratorio.
Para hacer cultivo in Vitro en laboratorio se utiliza
un aparato que se conoce como cabina de flujo laminar,
y que básicamente es un aparato que genera una suave corriente
de aire estéril, donde te permite trabajar en condiciones
de esterilidad. Esta corriente de aire estéril se genera
mediante un motor que hace pasar el aire normal a través
de dos filtros, uno retiene las impurezas grandes y el
siguiente que elimina hasta las esporas del ambiente.
No es muy difícil hacerse una de ellas, pero los materiales
son muy específicos y no se encuentran en cualquier parte,
además de ser relativamente caras (si
alguien se atreve le ayudo a conseguirlos).
Existen algunos aparatos de
aire acondicionado para alérgicos que tienen sistemas
de filtros para el polen que producen aire estéril y se
podría usar en cultivo in Vitro, pero ya hablamos de encarecer
el proceso y tratamos de hacer algo asequible a todo el
mundo. Por el sistema que he descrito, aficionados de
todo el mundo están reproduciendo sus híbridos a escala
doméstica.
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MÁS
INFORMACIÓN SOBRE EL TEMA PERO NO EN CASTELLANO:
http://www.8ung.at/ederer_thomas/orchideen/
http://www2.labs.agilent.com/botany/cp/slides/tc/hood.htm
José Manuel Sevillano
Vieira
dbvjsv@hotmail.com
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