Grupo Orquideófilo Canarias

 

Orquídeas: su cultivo in Vitro en el ámbito doméstico

 

El cultivo “in Vitro” se hace en frascos cerrados y en condiciones “controladas” y “estériles”. El sustrato de cultivo conocido normalmente como medio de cultivo ha de contener los elementos necesarios para que las plantas puedan crecer lo suficiente como para después ser trasplantadas al sustrato definitivo.

 

         MATERIALES.


¿Qué materiales nos hacen falta para llevar a cabo el cultivo in Vitro?.

1.- Medio de cultivo: componentes, obtención, mezclado, esterilización y  utilización, etc...
2.- Cámara de esterilidad: descripción-construcción, esterilización y uso.
3.-
 
Frascos de cristal con tapa (pueden ser potitos de niño, frascos pequeños de mermelada, miel, etc).
4.- Una olla a presión (que todo el mundo tiene en casa). Cuanto más grande mejor.
5.-
 
Bisturí y pinzas metálicas largas (más de 20 cm). Se compran en tiendas de materiales de laboratorio y ortopedia.
6.- Alcohol de 96º.
7.-
 
Algunos tarros de plástico (polipropileno PP) para microondas que sean bajos. (los he visto en tiendas “todo a cien” a precios económicos).

^

.- El medio de cultivo: sus componentes.

Estos elementos son básicamente: agua, sales minerales, azúcar, vitaminas, y en algunos casos hormonas vegetales. Además hace falta un elemento que dé consistencia al medio que suele ser el agar (antiguamente se usaba gelatina), aunque también es posible usar vermiculita.

La adición de extracto de levadura es muy beneficiosa pues proporciona vitaminas inusuales, algo de nitrógeno en forma de aminoácidos y oligopéptidos (fragmentos muy cortos de proteína de entre dos y 10 aminoácidos), oligoelementos y cofactores. 

 

PROPORCIÓN DE CADA ELEMENTO BÁSICO A MEZCLAR

 

    Abono mineral 20-20-20 (sin urea) 1 gr  
    Agar 8 gr  
    Agua 1 Litro  
    Azúcar comercial 10 gr  
    Extracto de levadura 1 gr  
    Complejo de vitamina B 1 ampolla, vial  
    Otros aditivos (leche de coco, plátano, etc) Leer bajo esta tabla  
       

Se puede añadir también: leche de coco verde filtrada por un filtro normal de café (20 ml por cada litro de medio), papilla de banana (muy fina) a razón de media banana por litro ó 25 ml de zumo de piña natural filtrado (NO el de Tetrabrik), aunque el zumo de piña no lo recomiendo si no se tiene forma de controlar el pH, pues es muy ácido y hay que corregirlo después, necesitando entonces de aparataje. Hay peachimetros muy económicos que siempre son útiles, pero se puede prescindir de ellos. 

A tener en cuenta que:

  • La leche de coco suele ir mejor para germinación o cultivo de tejidos y el plátano para el desarrollo de plántulas. No usar los dos a la vez.

  • La banana como aditivo funciona muy bien (que no esté pasado, los entre verdes y amarillos son ideales).

  • El agua preferiblemente destilada, pero se podría usar de lluvia siempre que esté bien limpia.

  • Si se usa vermiculita como soporte, no se añade agar.

^

Obtención de los elementos anteriores:

 
    Abono mineral:






 
En cualquier tienda de abonos. Si además trae magnesio, hierro y oligoelementos, mejor aún. Si no se encuentra de 20-20-20, se corrige de forma proporcional (Hay que tener en cuenta que la regla de tres es inversa). Un ejemplo, sería usar 2 gramos si el abono fuera de 10-10-10 ó 2,8 gramos, si el abono fuera de 7-7-7. Sin embargo es conveniente irse a la mayor concentración posible, debido a que cuanto más puro esté, menos residuo insoluble queda.  
    Azúcar comercial: Cualquier supermercado.  
    Extracto de levadura,
  vitamina B y agar:
En farmacias, tiendas de dietética y productos para deportistas.  
    Bananas, cocos,  piñas: En cualquier comercio.  
 

¿Cómo mezclamos todo esto?

Simplemente se disuelve todo en una parte del agua excepto el agar. Si se usa plátano debe hacerse papilla muy fina con una fracción de agua y después mezclarlo todo. Finalmente verificar el pH si se usa zumo de piña natural (debe quedar entre 5.5 y 6) y añadir el resto de agua necesaria. El pH lo podemos corregir adicionando una base fuerte (hidróxido sódico o potásico generalmente). Finalmente añadir el agar.

Esto se mete en el microondas y como el agar tarda en disolverse, para no calentar mucho la mezcla, serán necesarios varios golpes de calor hasta que se disuelva. Entre golpe y golpe se saca del microondas y se agita con una espátula o una cuchar.

Una vez disuelto el agar se espera a que enfríe un poco (básicamente para uno evitar quemarse) sin que llegue a volverse sólido y se vierte en los frascos de cultivo la cantidad necesaria. Finalmente se meten en la olla a presión para ser esterilizados.
 

 

 
Atención:

Este medio o substrato es muy rico en nutrientes, y al igual que crecen las plantas lo pueden hacer también hongos, levaduras y bacterias con lo cual necesitaremos que esté estéril.

Los medios una vez mezclados deben ser esterilizados, no pueden esperar en la nevera más de un día. Una vez esterilizados pueden conservarse hasta un mes, máximo dos a temperatura ambiente, o varios meses en la nevera (no el congelador).
 

Es conveniente que mientras se disuelve el agar la mezcla no llegue a hervir pues las vitaminas se descomponen si hierve repetidas veces.
 

 

.- Cámara de esterilidad: características básicas.

En cultivo in Vitro hablamos de esterilidad cuando no hay bacterias ni otros microorganismos: sólo está vivo el material vegetal que queremos hacer crecer.

Se hace una caja de metacrilato de unos 40 cm de altura por 60 de ancho y 40 de profundidad, sin fondo, que será la superficie de la mesa.

En la parte frontal se hacen unos orificios adecuados para introducir las manos a los que se les acoplan unos guantes largos. Por este sistema podremos trabajar sin tocar los materiales que estarán estériles.

Esbozo de cámara de esterilidad

La distancia entre agujeros y sobre todo el tamaño de los mismos va a ser variable, dependiendo principalmente de la altura de la mesa, de la silla sobre la que trabajaremos y de nuestra constitución física (a brazos más gruesos lógicamente agujeros más grandes). Sin embargo en el agujero debe haber algo de holgura para no cortarse en los brazos.

El modo de acoplar los guantes también se puede hacer de varias formas: Se pueden acoplar dos bolsas alargadas pegadas con cinta aislante al agujero por el exterior y al fondo dejar una abertura para las manos. Con las manos ya en la cámara nos ponemos unos guantes de látex (tipo cirujano) que se superponen parcialmente sobre la bolsa, pues son más sensibles para trabajar. Estos se pueden tratar con alcohol simplemente pulverizando con el que se va a esterilizar la cámara de modo que se evitan contaminaciones. Otra forma de acoplarlos es dejarlos permanentes, usando guantes de cocina lo más sensibles posible acoplándolos a la bolsa y fijándolos con cinta.

^

         PROCESOS DE ESTERILIZACIÓN:

.- Esterilización de materiales y medios de cultivo

 
    Olla a presión grande, cuanto más mejor.  
    Papel de aluminio.  
    Tarros para microondas con la indicación PP (Polipropileno).  
 

El medio de cultivo mezclado como anteriormente se indicó en "¿Cómo mezclamos todo esto?" se vierte en los frascos de mermelada, echando unos 3 cm de altura.

Éstos se introducen en la olla con la tapa del frasco floja pues si no se rompen (la olla por supuesto con agua, pero que no rebose los frascos).

El resto de los materiales (pinzas, tarros de microondas, etc) puede ir sobre los frascos (nunca nadando en el agua). También es conveniente tener trozos de papel de filtro y papel de aluminio estériles para poder hacer cualquier manipulación en esterilidad dentro de la cámara. Estos se pueden esterilizar previamente en la olla en tarros de microondas o envueltos en papel de aluminio. 

Una vez que están todos los materiales en la olla se cuecen 10 minutos (contados a partir de que empieza a hervir). Pasado ese tiempo se deja enfriar se sacan con cuidado y se aprietan (sin abrirlos) las tapas de los frascos de medio de cultivo. Se deja todo en un lugar fresco y seco hasta su uso.

 

 
Atención:

Todos los materiales han de estar envueltos en papel de aluminio y abrirlos sólo en la cámara de esterilidad una vez esterilizada
.

Es conveniente no usar los frascos preparados con el medio de cultivo hasta pasados tres o cuatro días, desechando los que se hayan contaminado (lo normal es que no se contamine ninguno). Guardados en un lugar fresco, pueden usarse hasta después de unos meses.
 

 

A tener en cuenta que:

  • En el caso de usar vermiculita como soporte para el cultivo, se ponen también unos 3 cm de vermiculita y se adiciona medio líquido (sin agar) hasta que se moje. Es muy importante que no haya exceso de líquido. Las semillas no deben (ni saben) nadar.

  • Algunos tarros para microondas no sirven. Tienen que tener la indicación PP (polipropileno). En algunos la tapa no es de polipropileno con lo cual estos no sirven, se derretirían en la olla a presión.

^

.- Esterilización de Semillas y cápsulas:

 
    Papel de filtro (ya esterilizado)  
    Un recipiente con Lejía al 20%  
    Tres recipientes con agua esterilizada  
    Pinzas metálicas  
    Bisturí  
 

Las semillas son muy pequeñas por lo que se usan pequeños sobrecitos hechos con papel de filtro, para esterilizar y lavar.

Cada sobrecito no debería contener más volumen de semilla que el equivalente a tres o cuatro granos de arroz. Esto supone unas 2000 a 20000 semillas dependiendo de las especies, cantidad más que suficiente para obtener suficientes seedlings. Como dato orientativo, con cápsulas grandes se puede hacer un mínimo de 10 ó 15 bolsitas.

Se esterilizan en lejía al 20% (1 parte de lejía y 4 de agua) durante 15-20 minutos, moviendo algo el sobrecito de vez en cuando para que la lejía actúe más eficientemente y no queden zonas no estériles, tratando de evitar que se rompa y salgan las semillas, pues después nos será casi imposible recogerlas. Después se lavan varias veces en agua estéril. Para este proceso, es necesario tener un frasquito con lejía al 20% y cuatro frasquitos estériles con agua para hacer cuatro lavados (2 ó 3 minutos cada lavado. Para pasar las semillas de uno a otro se toman los sobrecitos con las pinzas (que también han de estar estériles).

Si se usan cápsulas verdes, éstas interiormente están estériles (microbiológicamente), por lo que se manejan simplemente con las pinzas a través de la lejía y los lavados. Además no es necesario meterlas en los sobrecitos: se esterilizan por fuera y después de los lavados se abren (longitudinalmente) con el bisturí y se siembran las semillas inmaduras que hay en el interior. Cada especie tiene diferentes tiempos de recolección como cápsula verde y de maduración hasta semillas secas. Estos tiempos son extremadamente variables y van en ambos casos desde menos de un mes hasta varios años.

 

 
Atención:

Todos los materiales que toquen las semillas han de estar estériles (frascos, agua, etc), pues de lo contrario nos crecerán hongos y bacterias en vez de las semillas.

Todo el proceso (esterilización, lavado y siembra) ha de hacerse en la cámara de esterilidad (previamente esterilizada).

Del bien hacer dentro de la cámara dependerá el éxito del cultivo.
 

 

 

.- Esterilización de la cámara de esterilidad:

La cámara de esterilidad la podemos esterilizar de dos maneras:

a) Con la aplicación de alcohol de 70%, proceso.
b) Con lámparas germicidas, proceso. 
  Existen en el mercado tubos o lámparas germicidas fluorescentes económicas, semejantes a los de los rayos UVA, que emiten radiación ultravioleta y matan todo lo que hay en su radio de acción en unas 2 horas, sustituyendo al tratamiento con alcohol que es bastante engorroso. Estas lámparas se usan de forma industrial en alimentación (cámaras frigoríficas, pastelería, etc).

A tener en cuenta que:

  • Aunque la exposición humana momentánea a esta radiación no es nociva, no se debemos exponernos más de 2 minutos. El inconveniente es que hay que encenderla 2 horas antes de empezar a trabajar para dejarla apagada mientras trabajamos, pero es francamente útil. También es conveniente cubrir la cámara con un paño para evitar accidentes con la radiación.
           
    Procedimiento con Alcohol:
















 
Introducimos en la cámara todos los materiales (ya estériles) con los que tengamos que trabajar que han salido de la olla y están cubiertos por papel de aluminio, pues una vez esterilizada la cámara no se puede abrir, y si hay que hacerlo, la esterilización ha de repetirse de nuevo. Se nebuliza cuidadosamente con alcohol con la ayuda de un pulverizador toda la cámara, de manera que matemos todos los microorganismos que están continuamente flotando en el aire. Para evitar que los materiales se nos empapen de alcohol se cubren con papel de aluminio. Además es conveniente tener dentro papel de cocina para recoger todo el alcohol que se va depositando sobre la mesa. Antes de empezar a trabajar se debe esperar 5 minutos a que se deposite todo el alcohol nebulizado.    
    Procedimiento con lámparas germicidas.

 

Encender las lámparas durante dos horas, teniendo en cuanta las precauciones mencionadas anteriormente.    
           
 
 
 

Atención:
Durante la esterilización de la cámara, a las semillas hay que cubrirlas con papel de aluminio para que no les haga daño el alcohol ni la radiación.

 
 

Duración de la esterilización de la cámara:

Si la cámara está más o menos estanca (que no entre aire) se podría trabajar toda la tarde. Sin embargo, es conveniente tener en la cámara un vasito con alcohol que nos permita esterilizar de vez en cuando pinzas o bisturí, sobre todo si trabajamos con diferentes semillas, pues algunas podrían estar contaminadas y trasladar esta contaminación a otros materiales. Una inmersión del material durante unos minutos es suficiente (en una parada para tomar un café o descansar un ratito). El instrumental así esterilizado debe ser secado con un trozo de papel de filtro estéril previamente a volver a trabajar, pues el alcohol también es nocivo para las semillas de las orquídeas.

^

         SEMBRADO Y GERMINACIÓN

Se esterilizan las semillas y/o cápsulas en sobrecitos hechos de papel de filtro (para que entre la lejía), según he indicado. No sobrepasar los 20 minutos pues también mataríais las semillas. Algunas especies sí necesitan más de 20 minutos, pero no suele ser el caso de las orquídeas tropicales.
 

   Los sobrecitos se abren con las pinzas y bisturí sobre trozos de papel de aluminio estéril que hemos situado sobre las tapas de los tarros de microondas estériles y se introducen unas 100-200 semillas en cada frasco, lo más separadas posible (las semillas se pueden recoger del sobrecito con una cucharilla de café muy pequeña estéril).

 
En general, la germinación es mejor en oscuridad, así que después mejor guardar los frascos en una caja bien cerrada y observarlas semanalmente.

Después de unos 15 días a un mes (a veces más) se empiezan a ver las semillas engrosar y más adelante formar la yema apical y la primera raíz.

^

         REPICADO

Cuando tienen aproximadamente medio cm ya han consumido casi todo el nutriente, por lo que se cambian al mismo medio fresco, también en esterilidad dejando aproximadamente 10-30 plantitas por frasco y sacar ya a la luz (no luz directa, puede ser cerca de una ventana o en un lugar sin sol directo en el invernadero.

También se puede aplicar luz (y sería lo mejor) con 2 fluorescentes puestos a unos 30 cm de los frascos que estén funcionando 16 horas al día, pero encarece el proceso. Sin fluorescentes crecen un poco más despacio, pero para uso particular pueden valer perfectamente.

^

         PLANTADO EN SUSTRATO

Como norma general, cuando las plantas tienen unos 3-4 cm de alto (estén suficientemente desarrolladas), se pueden adaptar al sustrato.

Al principio se debe usar un sustrato menos poroso (puede ser vermiculita, abonada con abono líquido), y cubrirlas con bolsitas de plástico invertidas tipo celofán. La adaptación tiene que ser progresiva, pues estas plantitas tan pequeñas se secan muy rápidamente.

También los botellines de agua cortados por la mitad y puestos sobre la planta son ideales para evitar la deshidratación rápida. Poco a poco se va abriendo a intervalos de tiempo (o mejor haciendo pequeños agujeros en los botellines)  hasta que la planta ya puede crecer y desarrollarse sin protección como las demás.

Además, se hace necesario un tratamiento con un funguicida, pues en esta etapa de adaptación hay una fuerte tendencia a la infección por hongos. Cuando se ha desarrollado adecuadamente se la puede instalar en el sustrato definitivo que dependerá de la especie.

En laboratorio, con medios de cultivo más controlados, la luz adecuada y aparataje se pueden obtener plantas en menos de un año. En casa, en aproximadamente un año, se podrían poner las plántulas (seedlings) en sustrato, y a partir de otros dos años (dependiendo de la especie) podrían florecer.

--------------------------------

------------------

Tengo que señalar que esta no es la forma en que se hace el cultivo in Vitro en un laboratorio. Para hacer cultivo in Vitro en laboratorio se utiliza un aparato que se conoce como cabina de flujo laminar, y que básicamente es un aparato que genera una suave corriente de aire estéril, donde te permite trabajar en condiciones de esterilidad. Esta corriente de aire estéril se genera mediante un motor que hace pasar el aire normal a través de dos filtros, uno retiene las impurezas grandes y el siguiente que elimina hasta las esporas del ambiente. No es muy difícil hacerse una de ellas, pero los materiales son muy específicos y no se encuentran en cualquier parte, además de ser relativamente caras (si alguien se atreve le ayudo a conseguirlos).

Existen algunos aparatos de aire acondicionado para alérgicos que tienen sistemas de filtros para el polen que producen aire estéril y se podría usar en cultivo in Vitro, pero ya hablamos de encarecer el proceso y tratamos de hacer algo asequible a todo el mundo. Por el sistema que he descrito, aficionados de todo el mundo están reproduciendo sus híbridos a escala doméstica.

^

         MÁS INFORMACIÓN SOBRE EL TEMA PERO NO EN CASTELLANO:

http://www.8ung.at/ederer_thomas/orchideen/

http://www2.labs.agilent.com/botany/cp/slides/tc/hood.htm

 

José Manuel Sevillano Vieira

dbvjsv@hotmail.com

 

 

Hacia arriba